Når cellene er løsrevet, legg til 2 volumer av forvarmet komplett vekstmedium for å inaktivere trypsin. Disperger mediet forsiktig ved å pipettere over cellelagets overflate flere ganger for å sikre gjenvinning av >95 % av cellene.
Hvordan stopper jeg trypsinaktivitet?
Trypsinfordøyelsen kan stoppes ved frysing eller ved å senke pH til reaksjonen til under pH 4 ved å tilsette maursyre, eddiksyre eller trifluoreddiksyre (trypsin vil gjenvinne aktiviteten når pH heves over pH 4). Fordøyde prøver kan lagres ved -20°C.
Hva nøytraliserer trypsin?
A buffer som inneholder kalsium- og magnesiumioner vil også bremse trypsinaktiviteten. FBS er imidlertid den mer effektive måten å hemme trypsinaktivitet på.
Inaktiverer serum trypsin?
Serum inaktiverer gjenværende trypsin fra enzymatisk fordøyelse av nyrene og de proteolytiske enzymene som deretter syntetiseres av cellene. Fersk trypsiniserte celler kunne dyrkes til monolag i fravær av serum forutsatt at de ble vasket gjentatte ganger for å fjerne gjenværende trypsin.
Hvor mye media skal til for å deaktivere trypsin?
Så lenge du bruker minst 1:1-forhold av 5-10 % serum-holdig medium med trypsinet, bør det være mer enn tilstrekkelig hemming, etterfulgt av sentrifugering og middels bytte med ferskt medium.